Lyase Enzymes, Nucleic Acids Encoding Them and Methods for Making and Using Them

Abstract

This invention provides polypeptides having lyase activity, polynucleotides encoding these polypeptides, and methods of making and using these polynucleotides and polypeptides. In one aspect, the invention is directed to polypeptides having ammonia lyase activity, e.g., phenylalanine ammonia lyase, tyrosine ammonia lyase and/or histidine ammonia lyase activity, including thermostable and thermotolerant activity, and polynucleotides encoding these enzymes, and making and using these polynucleotides and polypeptides. The polypeptides of the invention can be used in a variety of pharmaceutical, agricultural and industrial contexts.

1 - 156 . (canceled) 
     
     
         157 . An isolated or recombinant polynucleotide that encodes a polypeptide having a tyrosine ammonia lyase and phenylalanine ammonia lyase activity, wherein the polynucleotide is selected from the group consisting of:
 (a) a nucleic acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more or complete sequence identity to SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:171, SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:179, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:207, SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:211, SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:223, SEQ ID NO:225, SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:249 or SEQ ID NO:251;   (b) a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having a sequence as set forth in set forth in SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:250 or SEQ ID NO:252; or   (c) a nucleic acid sequence complementary to (a), or (b).   
     
     
         158 . An expression cassette comprising the polynucleotide as set forth in  claim 157 . 
     
     
         159 . A vector comprising the polynucleotide as set forth in  claim 157 , wherein optionally the vector comprises an expression vector. 
     
     
         160 . A cloning vehicle comprising the polynucleotide as set forth in  claim 157 ,
 wherein optionally the cloning vehicle comprises a viral vector, a plasmid, a phage, a phagemid, a cosmid, a fosmid, a bacteriophage or an artificial chromosome,   and optionally the viral vector comprises an adenovirus vector, a retroviral vector or an adeno-associated viral vector, and optionally the cloning vehicle comprises a bacterial artificial chromosome (BAC), a plasmid, a bacteriophage P1-derived vector (PAC), a yeast artificial chromosome (YAC), or a mammalian artificial chromosome (MAC).   
     
     
         161 . A transformed cell comprising the polynucleotide as set forth in  claim 157 , wherein optionally the cell is a bacterial cell, a non-human mammalian cell, a fungal cell, a yeast cell, an insect cell or a plant cell. 
     
     
         162 . An isolated or recombinant polypeptide having a tyrosine ammonia lyase and phenylalanine ammonia lyase activity, wherein the polypeptide is selected from the group consisting of:
 (i) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:250 or SEQ ID NO:252;   (ii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid as set forth in  claim 157 ; or   (iii) a variant of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:250 or SEQ ID NO:252, wherein the variant has at least one amino acid residue conservative substitution to and the variant retains activity.   
     
     
         163 . An isolated or recombinant polypeptide comprising a polypeptide as set forth in  claim 162  and lacking a signal or leader sequence or a prepro sequence. 
     
     
         164 . An isolated or recombinant polypeptide comprising a polypeptide as set forth in  claim 162  and having a heterologous signal or leader sequence or a heterologous prepro sequence. 
     
     
         165 . A protein preparation comprising a polypeptide as set forth in  claim 162 , wherein the protein preparation comprises a liquid, a solid or a gel. 
     
     
         166 . A method of producing the polypeptide as set forth in  claim 162  comprising the steps of: (a) providing the nucleic acid as set forth in  claim 157  operably linked to a promoter; and (b) expressing the nucleic acid of step (a) under conditions that allow expression of the polypeptide, thereby producing a recombinant polypeptide. 
     
     
         167 . A method of generating a variant of the nucleic acid as set forth in  claim 157  comprising the steps of:
 ( a ) providing a template nucleic acid, wherein the template is the nucleic acid sequence as set forth in  claim 157 ; and 
 (b) modifying, deleting or adding one or more nucleotides in the template sequence, or a combination thereof, to generate a variant of the template nucleic acid 
 wherein optionally the method further comprises expressing the variant nucleic acid to generate a variant lyase polypeptide, 
 and optionally the modifications, additions or deletions are introduced by a method comprising error-prone PCR, shuffling, oligonucleotide-directed mutagenesis, assembly PCR, sexual PCR mutagenesis, in vivo mutagenesis, cassette mutagenesis, recursive ensemble mutagenesis, exponential ensemble mutagenesis, site-specific mutagenesis, gene reassembly, Gene Site Saturation Mutagenesis (GSSM), synthetic ligation reassembly (SLR), recombination, recursive sequence recombination, phosphothioate-modified DNA mutagenesis, uracil-containing template mutagenesis, gapped duplex mutagenesis, point mismatch repair mutagenesis, repair-deficient host strain mutagenesis, chemical mutagenesis, radiogenic mutagenesis, deletion mutagenesis, restriction-selection mutagenesis, restriction-purification mutagenesis, artificial gene synthesis, ensemble mutagenesis, chimeric nucleic acid multimer creation and a combination thereof, 
 and optionally the method is iteratively repeated until a lyase having an altered or different activity or an altered or different stability from that of a polypeptide encoded by the template nucleic acid is produced. 
 
     
     
         168 . A method for deaminating a phenylalanine, tyrosine or a histidine comprising the following steps:
 (a) providing the polypeptide as set forth in  claim 162 ;   (b) providing a composition comprising a phenylalanine, tyrosine or a histidine residue; and   (c) contacting the polypeptide of step (a) with the composition of step (b) under conditions wherein the polypeptide deaminates the phenylalanine, tyrosine or a histidine residue in the composition.   
     
     
         169 . A dough, a bread product, a beverage, a drink, a food, a feed, a nutritional supplement, an edible enzyme delivery matrix, or a pellet comprising the polypeptide as set forth in  claim 162 . 
     
     
         170 . A wood, a wood pulp, a wood product, a paper, a paper pulp, or a paper product comprising the polypeptide as set forth in  claim 162 . 
     
     
         171 . A detergent composition comprising the polypeptide as set forth in  claim 162 , wherein optionally the polypeptide is formulated in a non-aqueous liquid composition, a cast solid, a granular form, a particulate form, a compressed tablet, a gel form, a paste or a slurry form. 
     
     
         172 . A pharmaceutical composition or dietary supplement comprising the polypeptide as set forth in  claim 162 , wherein optionally the polypeptide is formulated as a tablet, gel, geltab, pill, implant, liquid, spray, powder, food, feed pellet, as an injectable formulation or as an encapsulated formulation. 
     
     
         173 . A method for processing a biomass material comprising contacting a composition with a polypeptide as set forth in  claim 162 , wherein optionally the biomass material is derived from an agricultural crop, is a byproduct of a food or a feed production, is a lignocellulosic waste product, or is a plant residue or a waste paper or waste paper product,
 and optionally the plant residue comprise stems, leaves, hulls, husks, corn cobs, corn stover, straw, wood, wood chips, wood pulp and sawdust,   and optionally the paper waste comprises discarded or used photocopy paper, computer printer paper, notebook paper, notepad paper, typewriter paper, newspapers, magazines, cardboard and paper-based packaging materials,   and optionally the processing of the biomass material generates a bioethanol.   
     
     
         174 . A dairy product comprising a polypeptide as set forth in  claim 162 . 
     
     
         175 . A textile or fabric comprising a polypeptide as set forth in  claim 162 .